Abstrakcyjny
W pracy przedstawiono wpływ szczepionki COVID-19 mRNA (Pfizer/BioNT) na komórki glejowe mózgu badane metodą spektroskopii Ramana i obrazowania in vitro. glejak inkubowany ze szczepionką Covid-19 mRNA szczepionką Pfizer/BioNT wykazują zmiany w szlakach redukcji-utleniania związanych z cytochromem c.
Odkryliśmy, że szczepionka Pfizer/BioNT obniża stężenie cytochromu c w mitochondriach po inkubacji z prawidłowymi i nowotworowymi komórkami glejowymi. Wykazano, że stężenie utlenionej postaci cytochromu c w komórkach mózgu zmniejsza się po inkubacji szczepionki mRNA. Niższe stężenie utlenionego cytochromu c skutkuje niższą efektywnością fosforylacji oksydacyjnej (oddychania), zmniejszoną apoptozą i zmniejszoną produkcją ATP. Zmiana stężenia amidu I, która może odzwierciedlać spadek translokatora nukleotydów adeninowych mRNA. Co więcej, szczepionka mRNA prowadzi do zmian w składzie biochemicznym lipidów, co sugeruje rosnącą rolę sygnalizacji. Szczepionka mRNA powoduje statystycznie istotne zmiany w jądrze komórkowym z powodu zmian histonów. Wyniki uzyskane dla mitochondriów, kropelek lipidów, cytoplazma może sugerować, że szczepionka COVID-19 mRNA (Pfizer/BioNT) przeprogramowuje odpowiedzi immunologiczne. Obserwowane zmiany w profilach biochemicznych po inkubacji z mRNA COVID-19 w określonych organellach komórek glejowych są podobne do tych, które obserwujemy w przypadku raka mózgu w porównaniu ze stopniem agresywności.
1. Wstęp
Pandemie COVID-19 były świadkiem eksplozji badań w dziedzinie immunometabolizmu, które ujawniły, że podobne mechanizmy regulują odpowiedź gospodarza na infekcje, autoimmunizację i raka. Nowe narzędzia obrazowania Ramana, które przedstawiamy w tym artykule, otwierają ekscytujące możliwości nowych sposobów zrozumienia szlaków naszych odpowiedzi immunologicznych, rozpoznawania metabolitów regulujących te szlaki i sugerują, jak możemy je wykorzystać do optymalizacji szczepień w celu stymulowania warunków adaptacyjnego układu odpornościowego.
Wybuch pandemii w 2019 r. wirusa SARS-COV-2 wywołujący zespół ostrej niewydolności oddechowej spowodował 230 418 451 potwierdzonych przypadków COVID-19, w tym 4 724 876 zgonów zgłoszonych do WHO. Do dnia 23 września 2021 r. podano łącznie 5 874 934 542 dawki szczepionki [ 1 ]. W odpowiedzi na pilną potrzebę szczepionki, firmy farmaceutyczne, w tym Pfizer/BioNT, w 2020 roku zaproponowały szczepionki oparte na technologii mRNA. Szczepionka Pfizer/BioNT (BNT162b2) jest skuteczna w ponad 90% przeciwko COVID-19 [ 2 ].
Aby dostać się do komórek gospodarza, wirus SARS-COV-2 wykorzystuje białko powierzchniowe S, tak zwane białko kolca (białko kolca). Szczepionki oparte na technologii mRNA są przeznaczone do wytwarzania przeciwciał przeciwko białku kolce. Szczepionki mRNA to szczepionki, w których kwas rybonukleinowy (RNA) jest używany jako matryca do produkcji białek wirusowych. Białka te mają za zadanie wywołać produkcję przeciwciał, które są następnie przenoszone do układu odpornościowego gospodarza.
W artykule przedstawiamy wpływ szczepionek mRNA na komórki glejowe mózgu, które są zaangażowane w naciekanie mikrośrodowiska guza, przy użyciu nowatorskiego nieinwazyjnego narzędzia, takiego jak obrazowanie Ramana. Tutaj pokazujemy, że obrazowanie ramanowskie ujawnia nowe możliwości w zakresie roli podstawowych mechanizmów patologii raka i wpływu szczepionek mRNA. Dzięki temu podejściu można monitorować interakcje w mikrośrodowisku guza i mechanizmy związane z odpowiedzią immunologiczną.
Spektroskopia Ramana i obrazowanie umożliwiające ilościowe i nieinwazyjne monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowych bez konieczności stosowania markerów zewnętrznych. Tradycyjne metody biologii molekularnej wymagają niszczenia błon komórkowych i izolacji składników wewnątrzkomórkowych w celu zbadania zmian biochemicznych wewnątrz komórek. W obrazowaniu ramanowskim nie musimy niszczyć komórek, aby poznać skład biochemiczny struktur wewnątrzkomórkowych (organelli komórkowych). Śledzenie zmian w składzie biochemicznym poszczególnych organelli jest niezwykle cenne w ustalaniu molekularnych mechanizmów rozwoju raka i mechanizmów infekcji. Do tej pory żadna technologia nie okazała się skuteczna w wykrywaniu stężenia określonych związków w oddzielnych organellach komórkowych. W związku z tym,
Skoncentrujemy się na normalnych i nowotworowych komórkach glejowych po inkubacji ze szczepionką mRNA. Powodem jest to, że choroby nowotworowe są najpoważniejszą przyczyną zgonów, przewyższając choroby serca, udary, zapalenie płuc i COVID-19. Chociaż w tej chwili nie ma szczepionki przeciwko większości nowotworów, szybki rozwój szczepionek mRNA może pomóc w opracowaniu szczepionek przeciwnowotworowych.
Ogłoszenie skutecznych i bezpiecznych szczepionek na COVID-19 zostało przyjęte z entuzjazmem. Według zebranych danych szczepionki stosowane obecnie w globalnej kampanii szczepień (3,36 miliarda dawek podano w 180 krajach [ https://www.bloomberg.com/graphics/covid-vaccine-tracker-global-distribution/ ).
Chociaż szczepionki przeciw COVID-19 niosą potencjalną nadzieję na powrót do pewnego rodzaju normalności, wiele podstawowych mechanizmów, za pomocą których szczepionki mRNA wywołują silne reakcje, jest wciąż nie do końca poznane i należy je kontynuować [ 2 ]. Szczepionka mRNA kodująca białko kolce COVID-19 (S) kapsułkowane w nanocząsteczkach lipidowych dostaje się do komórek dendrytycznych (DC) w miejscu wstrzyknięcia lub w węzłach chłonnych, co skutkuje wytwarzaniem wysokiego poziomu białka S.
Niemniej jednak wciąż jest wiele do nauczenia się. Nie jest jasne, która specyficzna aktywacja komórki najbardziej przyczynia się do skuteczności szczepionki, a jaka aktywacja może hamować wytwarzanie odporności nabytej lub prowadzić do słabej tolerancji szczepionki [ 3 ].
Istnieją kontrowersje dotyczące szkodliwego wpływu białka S kolce wytwarzanego przez szczepienie COVID-19 i skutków długoterminowych. Naukowcy ostrzegają, że szczepionka Pfizer-BioNTech przeciwko koronawirusowi 2019 (COVID-19) indukuje złożone przeprogramowanie wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, które należy wziąć pod uwagę przy opracowywaniu i stosowaniu szczepionek opartych na mRNA. Istnieją również kontrowersje dotyczące biodystrybucji szczepionek mRNA. Zostało zgłoszone [ 4], że szczepionki domięśniowe (którą jest szczepionką Pfizer/BioNT) u makaków (rodzaj małpy) pozostają w pobliżu miejsca wstrzyknięcia (mięsień ramienia) i lokalnych węzłów chłonnych, gdzie wytwarzane są białe krwinki i przeciwciała w celu ochrony przed chorobą. Układ limfatyczny, węzły chłonne również oczyszczają płyny i usuwają odpady. Podobne wyniki uzyskano dla szczepionki mRNA przeciwko wirusom grypy H10N8 i H7N9 u myszy [ 4 ]. Jednak ostatnie wyniki dotyczące interakcji między układem odpornościowym a białkami wirusowymi, które indukują odporność na COVID-19, mogą być bardziej złożone niż wcześniej sądzono [ 5]. Znaleziono dowody na to, że kolce białka S COVID-19 pozostają nie tylko w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, ale także krążą we krwi. Białka COVID-19 mierzono w podłużnych próbkach osocza pobranych od 13 uczestników, którzy otrzymali dwie dawki szczepionki mRNA-1273. 11 z 13 uczestników wykazało wykrywalne poziomy białka COVID-19 już pierwszego dnia po pierwszym wstrzyknięciu szczepionki. Usuwanie wykrywalnego białka COVID-19 korelowało z produkcją IgG i IgA [ 6 ].
W świetle ostatnich wyników ważne jest, aby mieć świadomość, że kolce białka S wytwarzane przez nowe szczepionki mRNA COVID-19 mogą również bezpośrednio wpływać na komórki gospodarza z długofalowymi konsekwencjami. W związku z tym należy monitorować biodystrybucję i lokalizację białka S wypustki ze szczepionek mRNA oraz wpływ białka S wypustki COVID-19 na ludzkie komórki gospodarza in vitro oraz odpowiednie eksperymentalne modele zwierzęce.
W tym artykule skupimy się na ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), ponieważ oprócz zapalenia płuc i ostrej niewydolności oddechowej, COVID-19 wiąże się z wieloma objawami związanymi z OUN, w tym utratą smaku i węchu, bólami głowy, drganiami. drgawki, splątanie, zaburzenia widzenia, nerwobóle, zawroty głowy, zaburzenia świadomości, nudności i wymioty, porażenie połowicze, ataksja, udar i krwotok mózgowy [ 7 ].
Nie jest jasne, czy koronawirus ciężkiego ostrego zespołu oddechowego, który powoduje COVID-19, może dostać się do mózgu. Postulowano, że niektóre objawy COVID-19 mogą być spowodowane bezpośrednim działaniem wirusa na OUN; na przykład objawy ze strony układu oddechowego mogą być częściowo spowodowane inwazją COVID-19 do ośrodków oddechowych mózgu [ 8 , 9 ]. Zapalenie mózgu zostało również zgłoszone w COVID-19 i może być wynikiem przedostania się wirusa lub białek wirusowych do mózgu [ 7 , 10 ].
mRNA COVID-19 został odzyskany z płynu mózgowo-rdzeniowego [ 11 ], co sugeruje, że może on przekraczać barierę krew-mózg (BBB). Inne koronawirusy, w tym blisko spokrewniony wirus SARS, który spowodował wybuch epidemii w latach 2003–2004, są w stanie przejść przez BBB [ 12 ], a COVID-19 może infekować neurony w modelu sfery mózgowej [ 13 ]. Jednak COVID-19 może wywoływać zmiany w OUN bez bezpośredniego przekraczania BBB, ponieważ COVID-19 jest związany z burzą cytokin, a wiele cytokin przechodzi przez BBB, aby wpływać na funkcję OUN [ 9 ]. Stwierdzono, że COVID-19 dociera do mózgu, infekuje astrocyty i wywołuje zmiany neuropatologiczne, które przyczyniają się do strukturalnych i funkcjonalnych zmian w mózgu pacjentów z COVID-19 .]. Naukowcy wyrazili obawę, że nanocząsteczki lipidów (LNP), które mogą szybko dyfundować, mogą potencjalnie uzyskać dostęp do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) przez opuszkę węchową lub krew. Należy to jednak ustalić w dalszych badaniach. Należy również zbadać rolę odpowiedzi pamięci wrodzonej na LNP [ 15 ].
Wizualizacja zmian w pojedynczych komórkach po dostarczeniu szczepionek mRNA pomogłaby w ocenie skuteczności preparatów kandydatów i pomogłaby w ich racjonalnym projektowaniu do badań przedklinicznych i translacyjnych. Tutaj pokazujemy, że obrazowanie ramanowskie pozwala na ilościowe i nieinwazyjne monitorowanie odpowiedzi na szczepionkę mRNA w określonych organellach bez żadnego znakowania.
W tym artykule będziemy badać implikacje dla możliwych konsekwencji szczepionki mRNA COVID-19 (Pfizer/BioNT BNT162b2) na ośrodkowy układ nerwowy (OUN). Przebadaliśmy już szczegółowo biochemiczne zmiany w określonych organellach komórek mózgowych w porównaniu z agresywnością raka. [ 16,17 ]] W ten sposób możemy porównać wpływ mRNA na komórki normalne i rakowe z efektem agresywności raka. O ile wiemy, szczepionka mRNA firmy Pfizer nie została przetestowana na pacjentach cierpiących na raka. Dlatego ten wkład pomoże w monitorowaniu odpowiedzi w komórkach mózgu gospodarza podobnych do infekcji wirusowej, ponieważ inkubacja ze szczepionką COVID-19 mRNA naśladuje infekcję COVID-19, ale zamiast całego wirusa syntetyzowane jest tylko jedno kluczowe białko S dla odpowiedzi immunologicznej , bez powodowania zakażenia COVID-19.
Będziemy badać normalne komórki glejowe ludzkiego mózgu i komórki glejaka in vitro: normalne ludzkie astrocyty (Clonetics NHA), ludzki gwiaździak CCF-STTG1 (ATTC CRL-1718) reprezentujący łagodnie agresywny nowotwór mózgu i ludzką linię komórkową glejaka U87-MG (ATCC HTB- 14) reprezentujący wysoce agresywny guz mózgu w obrazowaniu Ramana. Szczepionka mRNA naśladuje zakażenie COVID-19, ale zamiast całego wirusa syntetyzowane jest tylko jedno kluczowe białko S dla odpowiedzi immunologicznej, bez powodowania zakażenia COVID-19.
Będziemy monitorować wpływ szczepionki mRNA na biodystrybucję różnych składników chemicznych, w szczególności cytochromu c, w określonych organellach komórki: jądrze, mitochondriach, kropelkach lipidów, cytoplazmie i błonie.
W prezentowanym badaniu określimy dynamikę i skład biochemiczny organelli poprzez charakterystyczne widma Ramana po wstrzyknięciu szczepionki mRNA i inkubacji ze szczepionką komórkami in vitro.
Pokażemy również, że spektroskopia ramanowska i obrazowanie ramanowskie są konkurencyjnymi narzędziami diagnostyki klinicznej chorób nowotworowych związanych z dysfunkcją mitochondriów i stanowią warunek wstępny skutecznej farmakoterapii nowotworów.
W tym artykule badamy zmiany w szlakach redukcyjno-oksydacyjnych związanych z Cyt c w normalnych komórkach ludzkiego mózgu i komórkach nowotworowych po inkubacji in vitro ze szczepionką COVID-19 (Pfizer/BioNT BNT162b2).
2. Materiały i metody
2.1. Odczynniki
Cytochrom c (C 2506) zakupiono z Sigma Aldrich (Polska).
2.2 Hodowla komórek in vitro i inkubacja ze szczepionką
Badania przeprowadzono na normalnych ludzkich astrocytach (Clonetics NHA), ludzkim gwiaździaku CCF-STTG1 (ATTC CRL-1718) i linii komórkowej ludzkiego glejaka U87-MG (ATCC HTB-14) zakupionych od Lonza (Lonza Walkersville. Inc., Walkersville, MA, USA) i American Type Culture Collection (ATCC). Komórki NHA utrzymywano w Astrocyte Medium Bulletkit Clonetics (AGM BulletKit, Lonza CC-3186) i Reagent Pack (Lonza CC-5034) bez antybiotyków w nawilżanym inkubatorze w 37°C i 5% CO2 atmosfery . Komórki U87MG utrzymywano w Eagle's Minimal Essential Medium z L-glutaminą (ATCC 30-2003) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (ATCC 30-2020) bez antybiotyków w nawilżanym inkubatorze w 37°C i 5% CO 2atmosfera. Komórki CRL-1718 utrzymywano w pożywce RPMI 1640 (ATCC 30-2001) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (ATCC 30-2020) bez antybiotyków w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37°C i atmosferze 5 % CO2. Komórki wysiano w oknie CaF 2 (Crystran Ltd., Poole, Wielka Brytania; CaF 2Optycznie polerowane okienko klasy Raman o średnicy 25 mm × 1 mm grubości, nr CAFP25-1R, Poole, Wielka Brytania) na 35 mm płytce Petriego przy gęstości 5 × 104 komórek na płytkę Petriego. Po 24 godzinach inkubacji komórek w czystej pożywce hodowlanej komórki uzupełniono szczepionką w różnych wariantach czasu i stężenia. COVID-19 mRNA (szczepionka Pfizer/BioNT została rozcieńczona w 1,8 mL 0,9% chlorku sodu. Całkowita objętość zużytych szalek Petriego wynosiła 3 mL, tak więc dodaliśmy 180 µL rozcieńczonej szczepionki do 3 mL czysta pożywka hodowlana Rzeczywista dawka szczepionki podana pacjentom wynosi 2,25 ml/6= 0,3 ml, co odpowiada 30 µg na dawkę [ 18]. Trudno oszacować objętość ciała, w której szczepionka jest rozcieńczana u prawdziwych pacjentów. Stosowane przez nas dawki 1 µL/mL i 60 µL/mL odpowiadają dawce podanej podczas szczepienia prawdziwych pacjentów przy założeniu dystrybucji miejscowej w miejscu iniekcji i około 100 razy większej, gdy stosujemy objętość płynów u człowieka ciało). Przed badaniem Ramana komórki utrwalano 4% roztworem formaliny (buforowanym neutralnie) przez 10 minut i trzymano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, nr 10010023, Gibco) podczas doświadczenia.
2.3. Obrazowanie ramanowskie i spektroskopia
Spektroskopia Ramana to technika analityczna, w której do uzyskania informacji o energii drgań analizowanych próbek wykorzystuje się nieelastyczne światło rozproszone. W zdecydowanej większości przypadków rozpraszania energia cząsteczki pozostaje niezmieniona po jej interakcji z fotonem; a zatem długość fali rozproszonego fotonu jest równa długości fali padającego fotonu. Nazywa się to elastycznym (energia rozpraszanej cząstki jest zachowana) lub rozpraszaniem Rayleigha i jest dominującym procesem podczas oddziaływania fotonu z cząsteczką. W znacznie rzadszym przypadku (około 1 na 10 milionów fotonów) występuje rozpraszanie Ramana, które jest nieelastycznym procesem rozpraszania z transferem energii między cząsteczką a rozproszonym fotonem. Jeśli cząsteczka zyskuje energię od fotonu podczas rozpraszania (wzbudzona do wyższego poziomu drgań), wówczas rozproszony foton traci energię i zwiększa się jego długość fali, co nazywa się rozpraszaniem Stokesa Ramana. I odwrotnie, jeśli cząsteczka traci energię poprzez rozluźnienie do niższego poziomu wibracyjnego, rozproszony foton zyskuje odpowiednią energię, a jego długość fali maleje; co nazywa się rozpraszaniem antystokesowskim Ramana. Pod względem mechaniki kwantowej Stokes i Anti-Stoke są równie prawdopodobnymi procesami. Jednak w przypadku zespołu molekuł większość molekuł będzie znajdować się na poziomie drgań podłoża (rozkład Boltzmanna), a rozpraszanie Stokesa jest statystycznie bardziej prawdopodobnym procesem. W konsekwencji rozpraszanie Stokesa Ramana jest zawsze bardziej intensywne niż składnik Anti-Stokesa i z tego powoduSchemat 1 przedstawia ilustrację rozproszenia Ramana Rayleigha, Stokesa i Anti-Stokesa.
Schematyczne przedstawienie zjawisk rozpraszania.
Obrazowanie ramanowskie to technika oparta na rozpraszaniu ramanowskim, umożliwiająca nie tylko akwizycję pojedynczego widma charakterystycznego dla pojedynczego punktu próbki, ale także analizę widm oscylacyjnych dowolnego obszaru próbki. Tryb obrazowania umożliwia analizę rozmieszczenia różnych cząsteczek chemicznych w próbce. Korzystanie z algorytmów takich jak Analiza skupień (patrz rozdział 2.4 ) opartych na danych 2D uzyskanych za pomocą obrazowania ramanowskiego umożliwia tworzenie map ramanowskich w celu wizualizacji podstruktur komórki: jądra komórkowego, mitochondriów, struktur lipidowych, cytoplazmy, błony komórkowej oraz poznania ich bioskładu.
Schematyczne porównanie pojedynczych widm Ramana i trybów obrazowania Ramana akwizycji danych.
Widma Ramana i obrazy rejestrowano za pomocą konfokalnego mikroskopu Ramana (WITec (alpha 300 RSA+), Ulm, Niemcy) w Laboratorium Laserowej Spektroskopii Molekularnej Politechniki Łódzkiej. Mikroskop Ramana składał się z mikroskopu Olympus (Olympus Düsseldorf, Niemcy), monochromatora UHTS (Ultra-High-Throughput Screening) (WITec, Ulm, Niemcy) oraz termoelektrycznie chłodzonej kamery CCD ANDOR Newton DU970N-UVB-353 (EMCCD (Electron Multiplying) Charge Coupled Device, Andor Technology, Belfast, Irlandia Północna) o formacie 1600 × 200 pikseli, każdy o wymiarze 16 µm) w temperaturze -60° C z pełnym pionowym binningiem. Do pomiarów linii komórkowych zastosowano 40-krotny obiektyw immersyjny (Zeiss, W Plan-Apochromat 40x/1,0 DIC M27 (FWD = 2,5 mm), VIS-IR). Laser wzbudzający przy 532 nm był skupiony na próbce do plamki lasera 1 µm i był sprzężony z mikroskopem przez światłowód o średnicy 50 µm. Średnia moc wzbudzenia lasera wynosiła 10 mW, a czas zbierania wynosił 0,5 i 1 s dla obrazów ramanowskich. Obrazy Ramana rejestrowano z rozdzielczością przestrzenną 1 × 1 µm. Mikrospektrometr Ramana był kalibrowany codziennie przed pomiarami przy użyciu płytki krzemionkowej z maksymalnym pikiem przy 520,7 cm-1 .
2.4. Przetwarzanie danych
Akwizycję i przetwarzanie danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania WITec Project Plus. Odejmowanie tła i normalizację (model: podzielony przez normę (podzielenie widma przez normę zbioru danych)) przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Origin. Model normalizacji: podzielony przez normę wykonano według wzoru:
gdzie:
v n to n- te V wartości.
Normalizację przeprowadzono oddzielnie dla niskich (500-1800 cm -1 ) i wysokich (2600-3500 cm -1 ) obszarów widmowych.
Dla każdej organelli komórki zarejestrowaliśmy setki widm Ramana (ponieważ zarejestrowaliśmy jedno widmo Ramana dla każdego punktu obszaru obrazowania zaznaczonego na czerwono na obrazie mikroskopowym Schematu 2 z rozdzielczością 1 µm. Użyliśmy Cluster Metoda analizy zaimplementowana w oprogramowaniu projektowym WITec do obliczania średnich widm Ramana.
2.5. Analiza skupień
Dane spektroskopowe analizowano metodą Cluster Analysis. W skrócie Analiza skupień to forma eksploracyjnej analizy danych, w której obserwacje są podzielone na różne grupy, które mają pewne wspólne cechy – w naszym przypadku cechy oscylacyjne. Analiza skupień konstruuje grupy (lub klasy lub skupienia) w oparciu o zasadę, że: w ramach grupy obserwacje muszą być jak najbardziej podobne, natomiast obserwacje należące do różnych grup muszą być różne.
Podział n obserwacji (x) na k (k≤n) skupień S należy wykonać, aby zminimalizować wariancję (Var) według wzoru:
gdzie
μ i jest średnią punktów S i .
Przedstawione w manuskrypcie mapy ramanowskie skonstruowano w oparciu o opisane powyżej zasady Analizy skupień. Liczba skupień wynosiła 7 (minimalna liczba skupień charakteryzujących się różnymi średnimi widmami Ramana, które opisują różnorodność niejednorodnej próbki biologicznej).
3. Wyniki
Aby poznać zmiany w składzie biochemicznym organelli komórkowych metodami konwencjonalnej biologii molekularnej, należy rozerwać komórkę, aby uwolnić strukturę komórkową, aby oszacować frakcje wzbogacone o określone organelle. Korzystając z obrazowania ramanowskiego, nie musimy niszczyć komórek, aby poznać lokalizację, rozmieszczenie i skład biochemiczny określonych związków w różnych organellach. Aby właściwie zająć się zmianami w pojedynczych komórkach mózgu po inkubacji ze szczepionką COVID-19 Pfizer/BioNT, systematycznie badaliśmy, w jaki sposób spektroskopia Ramana i obrazowanie Ramana monitorują reakcje na szczepionkę w określonych organellach.
Figura 1 przedstawia obraz Ramana pojedynczej komórki glejaka (U-87 MG) wysoce agresywnego guza mózgu inkubowanego ze szczepionką Pfizer/BioNT opartą na mRNA (dawka 60 µl/ml) przez 96 godzin i odpowiadające mu obrazy ramanowskie specyficznych organelli. Obrazy ramanowskie zostały utworzone za pomocą analizy skupień K-średnich przy użyciu 7 skupień. Kolor niebieski reprezentuje lipidy, w tym szorstką siateczkę endoplazmatyczną i kropelki lipidów (wypełnione retinoidami), kolor pomarańczowy reprezentuje kropelki lipidów (wypełnione triacyloglicerolami typu jednonienasyconego (TAG), kolor purpurowy reprezentuje mitochondria, kolor czerwony reprezentuje jądro komórkowe, zielona cytoplazma i jasnoszary – membrana (ciemnoszary kolor odpowiada środowisku komórki).
Obraz mikroskopowy (A), obraz Ramana komórki glejaka (U-87 MG) (30×20 µm, rozdzielczość 1,0 µm) inkubowanych ze szczepionką Pfizer/BioNT (dawka 60 µl/ml) przez 96 godzin (B) i wyobraża sobie specyficzne organelle: lipidy i kropelki lipidów (niebieskie i pomarańczowe), mitochondria (magenta), jądro (czerwone), cytoplazma (zielona), błona (jasnoszary), środowisko komórkowe (ciemnoszary) przy 532 nm.
Postać. 2 przedstawia obraz Ramana pojedynczej komórki gwiaździaka (CRL-1718) łagodnie agresywnego guza mózgu i odpowiadające obrazy Ramana specyficznych organelli inkubowanych ze szczepionką mRNA z Pfizer/BioNT (dawka 60 µl/ml) przez 96 godzin. Obrazy ramanowskie zostały utworzone za pomocą analizy skupień K-średnich przy użyciu 7 skupień z tymi samymi kolorami kodowania, jak na Fig.1 .
Obraz mikroskopowy (A), obraz Ramana komórki gwiaździaka (CRL1718) (65×60 µm, rozdzielczość 1,0 µm) inkubowanej ze szczepionką Pfizer/BioNT (dawka 60 µl/ml) przez 96 godzin (B) i wyobrażenia Ramana określonych organelli: lipidy i kropelki lipidów (niebieskie i pomarańczowe), mitochondria (magenta), jądro (czerwone), cytoplazma (zielona), błona (jasnoszary), środowisko komórkowe (ciemnoszary) przy 532 nm.
Postać. 3 przedstawia obraz Ramana pojedynczej normalnej komórki astrocytu (NHA) i odpowiadające mu obrazy Ramana specyficznych organelli. Obrazy ramanowskie zostały utworzone za pomocą analizy skupień K-średnich przy użyciu 7 skupień o takich samych kolorach kodowania jak na Fig. 1 .
Obraz mikroskopowy (A), obraz Ramana komórki astrocytu (NHA) (100×45 µm, rozdzielczość 1,0 µm) inkubowanej ze szczepionką Pfizer/BioNT (dawka 60 µL/mL) przez 96 godzin (B) i wyobrażenia Ramana określonych organelli: lipidy i kropelki lipidów (niebieskie i pomarańczowe), mitochondria (magenta), jądro (czerwone), cytoplazma (zielona), błona (jasnoszary), środowisko komórkowe (ciemnoszary) przy 532 nm.
Aby właściwie zająć się zmianami w komórkach guza mózgu po inkubacji ze szczepionką COVID-19 (Pfizer/BioNT), systematycznie badaliśmy, w jaki sposób obrazowanie Ramana i spektroskopia monitorują odpowiedź normalnych komórek ludzkiego mózgu in vitro i komórek o różnej agresywności.
3.1. mRNA mitochondriów
Postać. 4 przedstawia wpływ szczepionki Pfizer/BioNT na mitochondria w komórkach glejaka (U87 MG), gwiaździaku (CRL-1718) i normalnych komórkach astrocytu (NHA) za pomocą obrazowania Ramana. Fig 4 przedstawia porównanie średnich widm Ramana (znormalizowanych przez normę wektorów) dla mitochondriów przy wzbudzeniu 532 nm zi bez szczepionki mRNA.
Wpływ szczepionki Pfizer/BioNT na mitochondria w komórkach glejaka (U87 MG)
, komórki glejaka (U87 MG) po inkubacji ze szczepionką Pfizer/BioNT przez 96h
, gwiaździak (CRL-1718)
, komórki gwiaździaka (CRL1718) po inkubacji ze szczepionką Pfizer/BioNT przez 96h
, normalne astrocyty (NHA)
, oraz normalne astrocyty (NHA) po inkubacji ze szczepionką Pfizer/BioNT przez 96 godzin
(liczba komórek dla każdego typu komórki: 3, liczba widm Ramana dla każdej pojedynczej komórki: minimum 1600, długość fali wzbudzenia: 532 nm, moc lasera: 10 mW, czas całkowania: 1,0 sek.).
Szczegółowa analiza rys. 4 pokazuje, że najbardziej znaczące zmiany zachodzą przy 1584 cm -1 . Pik przy 1584 cm -1 reprezentuje „ramanowski marker stanu redoks” stężenia Cytc. Ostatnio wykazaliśmy, że ta wibracja ramanowska może służyć jako czuły wskaźnik stężenia cytochromu c i koreluje z agresywnością nowotworu [ 16 ]. Wykazaliśmy, że intensywność Ramana prążka przy 1584 cm -1 odpowiadająca stężeniu cytochromu c w mitochondriach komórki in vitro zmniejsza się wraz z agresywnością guza mózgu. [ 16,17 ]
W skrócie, cytochromy są klasyfikowane na podstawie ich najniższego pasma absorpcji energii elektronowej w stanie zredukowanym. Możemy więc wyróżnić cytochrom P450 (450 nm), cytochrom c (550 nm), cytochrom b (≈565 nm), cytochrom a (605 nm). Cytochromy zlokalizowane są w łańcuchu transportu elektronów w kompleksie zwanym kompleksem III lub koenzymem Q – reduktazą Cyt C, zwanym też czasem kompleksem cytochromu bc1 (cytochrom b, cytochrom c1). Cytochrom c, który jest redukowany do cytochromu c Fe 2+ przez elektron z kompleksu III do kompleksu IV, gdzie przechodzi elektron do dwujądrowego centrum miedzi, utleniając się z powrotem do cytochromu c (cyt c Fe +3). Kompleks IV jest ostatnim enzymem układu transportu elektronów. Kompleks IV zawiera dwa cytochromy a i a3 oraz dwa centra miedzi.
Do tej pory żadna technologia nie okazała się skuteczna w wykrywaniu stężenia Cyt c w określonych organellach komórkowych. Istniejące technologie analityczne, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA) , Western blot , wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), spektrofotometria i cytometria przepływowanie może wykryć pełnego zakresu lokalizacji Cyt c wewnątrz i na zewnątrz określonych organelli. Dlatego żadna z metod stosowanych do kontrolowania stężenia Cyt c nie może dostarczyć bezpośrednich dowodów na rolę cytochromu c w apoptozie i fosforylacji oksydacyjnej, ponieważ nie są one w stanie monitorować ilości cytochromu w określonych organellach, takich jak mitochondria, cytoplazma lub zewnątrzkomórkowe matryca. Obrazowanie ramanowskie nie musi zakłócać komórek, aby otworzyć yjrm, uwolnić struktury komórkowe i poznać ich skład biochemiczny. Ostatnio pokazaliśmy [ 16 , 19], że stężenie Cyt c w tkankach nowotworowych wzrasta wraz z agresywnością raka. Wskazuje to, że stężenie netto Cyt c w mitochondriach jest wyższe niż uwalnianie do cytoplazmy. To odkrycie odzwierciedla podwójne oblicze Cyt w decyzjach dotyczących życia i śmierci: apoptozę i fosforylację oksydacyjną. Równowaga między proliferacją komórek nowotworowych (fosforylacja oksydacyjna) a śmiercią (apoptoza) decyduje o stopniu rozwoju nowotworu. Stężenie Cyt c w mitochondriach jako funkcja agresywności nowotworu odzwierciedla jej udział w fosforylacji oksydacyjnej i apoptozie. [ 16,19 ]W przeciwieństwie do tego, w pojedynczych komórkach in vitro, gdzie interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową są eliminowane, trend jest odwrotny niż w tkankach nowotworowych. Wyniki biochemiczne uzyskane za pomocą obrazowania Ramana wykazały, że pojedyncze ludzkie komórki in vitro wykazują brak równowagi redoks poprzez regulację w dół cytochromu c w nowotworach.
Na rycinie 4 widać , że sygnał Ramana utlenionego cytochromu c jest najsilniejszy dla komórek kontrolnych gwiaździaka, a najsłabszy dla glejaka o wysokim stopniu złośliwości (U-87 MG). Wskazuje to, że wraz z agresywnością nowotworu zmniejszają się procesy fosforylacji oksydacyjnej i apoptozy.
Rys. 4 pokazuje również znaczące zmiany przy 1654 cm -1 odpowiadające drganiom amidu I. Intensywność prążka przy 1654 cm -1 zmniejsza się dla glejaka wielopostaciowego U87 MG po inkubacji z mRNA. Istnieją doniesienia, że zmiany w potencjale błony mitochondrialnej sprzyjają degradacji funkcjonalnej translokatora nukleotydów adeninowych (ANT), który należy do rodziny nośników mitochondrialnych [ 20 ]. Ponieważ ANT stanowi około 10% białek w mitochondriach, obserwowany na ryc. 4 spadek po inkubacji z mRNA może odzwierciedlać to pogorszenie. Postać. 5przedstawia porównanie średnich widm Ramana (znormalizowanych według normy wektorowej) uzyskanych dla mitochondriów w komórkach glejaka (U87 MG), gwiaździaku (CRL-1718) i normalnych komórkach astrocytu (NHA) ze szczepionką mRNA i bez niej dla wzbudzenia 532 nm.
Znormalizowana intensywność Ramana pasma 1584 cm -1 , (na podstawie widm Ramana znormalizowanych przez normę wektorową) uzyskana dla mitochondriów w normalnych komórkach astrocytu (NHA) (A,B), gwiaździaka (CRL-1718) (A,C ) oraz komórki glejaka (U87 MG)(A,D) bez szczepionki Pfizer/BioNT (kontrola, niebieska) oraz ze szczepionką Pfizer/BioNT: dawki 1 µL/mL i 60 µL/mL, czas inkubacji 1h-magenta, czas inkubacja 24h-zielony, czas inkubacji 96h-czerwony. Do obliczenia wartości istotności zastosowano jednoczynnikową ANOVA z użyciem testu Tukeya, gwiazdka * oznacza, że różnice są istotne statystycznie, wartość p ≤ 0,05.
Widać, że znormalizowana intensywność Ramana prążka przy 1584 cm -1 odpowiadająca stężeniu cytochromu c w mitochondriach komórek in vitro zmniejsza się po inkubacji ze szczepieniem mRNA w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Efekt ten zależy od agresywności guza mózgu. Obserwacje zilustrowane na Figurze 5 potwierdzają, że inkubacja ze szczepionką mRNA zmniejsza stężenie cytochromu c dla gwiaździaka CRL1718 z istotnością statystyczną. Niższe stężenie cytochromu c po inkubacji z mRNA obserwowane w przypadku gwiaździaka prowadzi do zmniejszenia potencjału błony mitochondrialnej, zmniejszenia fosforylacji oksydacyjnej (oddychania) i apoptozy oraz zmniejszenia wytwarzania ATP . [ 16,17 ]
Wyniki przedstawione na ryc. 5 sugerują, że szczepionka Pfizer/BioNT przeciwko COVID-19 przeprogramowuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną poprzez regulację w dół cytochromu c. Wniosek ten opiera się na obserwacji, że cytochrom c może odgrywać rolę uniwersalnych cząsteczek DAMP (wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem) zdolnych do alarmowania układu odpornościowego o niebezpieczeństwie w każdym typie komórki lub tkanki i przyczyniającej się do obrony gospodarza [ 21 ]. ]. Wzory molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP) to endogenne cząsteczki niebezpieczne, które są uwalniane z uszkodzonych lub umierających komórek i aktywują wrodzony układ odpornościowy poprzez interakcję z receptorami rozpoznającymi wzorce (PRR).
Nasze dotychczas przedstawione wyniki w pełni potwierdzają te sugestie [ 17 , 21 ]. Cytochrom c jest kluczowym białkiem niezbędnym do utrzymania życia (oddychanie poprzez fosforylację oksydacyjną) i śmierci komórki (apoptoza). W rezultacie cytochrom c jest kluczowym białkiem w rozwoju raka. Pandemie były świadkiem eksplozji badań nad wzajemnymi zależnościami między odpowiedzią immunologiczną a wewnątrzkomórkowymi szlakami metabolicznymi, które w niej pośredniczą. Badania w dziedzinie immunometabolizmu ujawniły, że podobne mechanizmy regulują odpowiedź gospodarza na infekcje, autoimmunizację i raka. Nasze wyniki sugerują, że trójkąt: cytochrom c – rak – układ odpornościowy jest silnie powiązany.
Odkryliśmy, że istnieje bardzo ścisły związek między cytochromem c a układem odpornościowym poprzez kwas retinowy [ 22 ]. Kwas retinowy (RA) jest niezbędną cząsteczką we wrodzonym układzie odpornościowym, która nie stymuluje swojej ATPazy i prowadzi do braku indukcji cytokin. Fig . 6 przedstawia wpływ kwasu retinowego na cytochrom c w komórkach U87 MG glejaka.
Średnie widma Ramana dla mitochondriów dla komórek glejaka U87-MG bez (fiolet) i po 24-godzinnej inkubacji z kwasem retinowym (c= 50 µM, różowy), (wszystkie widma reprezentują średnią arytmetyczną 3 widm charakterystycznych dla mitochondriów analizowanych komórek, obliczone na podstawie minimum 1600 pojedynczych widm Ramana, długość fali wzbudzenia 532 nm, moc lasera 10 mW, czas całkowania 1,0 s).
Szczegółowa kontrola na rysunku. 6 pokazuje, że najbardziej znaczące zmiany zachodzą przy 1584 cm -1 , co odpowiada zredukowanej postaci cytochromu c. Intensywność Ramana cytochromu c drastycznie wzrasta po inkubacji komórek U87 MG z kwasem retinowym i reprezentuje formę zredukowaną [ 16 , 17 ] w przeciwieństwie do formy utlenionej obserwowanej bez inkubacji RA. Inkubacja in vitro z kwasem retinowym zwiększa ilość zredukowanej formy cytochromu c.
Nasze wyniki z ryc. 6 potwierdzają wniosek, że kwas retinowy jest kluczowym graczem w odporności [ 23 ]. Co więcej, ostatnio wykazano, że RIG-1 (gen indukowany kwasem retinowym) wyzwala nieudolną sygnalizacyjną obronę anty-COVID-19 w ludzkich komórkach płuc [ 24 ].
3.3. Jądro -mRNA
Większość naukowców twierdzi, że szczepionka mRNA nigdy nie wchodzi do jądra komórki, w którym przechowywane jest nasze DNA (materiał genetyczny) [ 3 ]]. Komórka rozpada się i pozbywa się mRNA wkrótce po zakończeniu zgodnie z instrukcjami. Zakłada się, że z wielu powodów jest nieprawdopodobne, aby szczepionka RNA zmieniła nasze DNA. Po pierwsze, ani koronawirus, ani szczepionki RNA (które kodują tylko białko wypustek) nie mają odwrotnej transkryptazy. Dlatego szczepionki RNA nie mogą wytwarzać cząsteczek DNA. Innym powodem jest to, że komórki utrzymują swoje przedziały dobrze oddzielone, a informacyjne RNA nie mogą przemieszczać się z cytoplazmy do jądra. Dlatego mRNA szczepionki nie może zbliżyć się nawet do DNA, nie mówiąc już o jego zmianie. Ponadto mRNA są krótko żyjącymi cząsteczkami. Posłaniec szczepionki nie pozostaje w komórce w nieskończoność, ale po kilku godzinach ulega degradacji, nie pozostawiając śladu. Wreszcie, badania kliniczne na tysiącach osób, które otrzymały szczepionki RNA, jak dotąd nie wykazały żadnych oznak modyfikacji DNA. To chyba najlepsza wskazówka, że te szczepionki nie zmieniają naszego genomu.
Dlatego szczególnie ważne jest monitorowanie zmian w jądrze po inkubacji z mRNA za pomocą obrazowania Ramana. Figura 7 przedstawia wyniki uzyskane dla jądra bez i po inkubacji ze szczepionką za pomocą spektroskopii Ramana i obrazowania.
Znormalizowana intensywność Ramana pasma 1584 cm -1 , (na podstawie widm Ramana znormalizowanych przez normę wektorową) uzyskana dla jądra w normalnych komórkach astrocytu (NHA) (A,B), gwiaździaka (CRL-1718) (A,C ) oraz komórki glejaka (U87 MG)(A,D) bez szczepionki Pfizer/BioNT (kontrola, niebieska) oraz ze szczepionką Pfizer/BioNT: dawki 1 µL/mL i 60 µL/mL, czas inkubacji 1h-magenta, czas inkubacja 24h-zielony, czas inkubacji 96h-czerwony. Do obliczenia wartości istotności zastosowano jednoczynnikową ANOVA z użyciem testu Tukeya, gwiazdka * oznacza, że różnice są istotne statystycznie, wartość p ≤ 0,05.
Ogólnie rzecz biorąc, nasze wyniki wydają się potwierdzać wnioski, że szczepionka mRNA nie wchodzi do DNA komórki. Rysunek . 7 pokazuje, że nie ma statystycznego znaczenia dla aktywności cytochromu c dla normalnych astrocytów NHA i U87 MG przy dawce 60 µl/ml. W przeciwieństwie do tego można zaobserwować pewne statystycznie istotne zmiany dla gwiaździaka dla dawki 60 µl/ml dla czasu inkubacji 96h, a dla komórek glejaka U87-MG dla małej dawki 1 µl/ml przez 24h. Ponieważ uważa się, że szczepionka mRNA nie wprowadza żadnych zmian odpowiadających DNA, interpretujemy ten wynik jako zmiany potranslacyjne w histonach, a nie w DNA. Może to wskazywać, że po inkubacji ze szczepionką mRNA zachodzą potranslacyjne zmiany w histonach jądra.
3.4. Kropelki lipidowe-mRNA i szorstka retikulum endoplazmatyczne
Istotne zmiany stężenia cytochromu c występują nie tylko w mitochondriach. Podobne zmiany w składzie biochemicznym cytochromu c odzwierciedlone przez prążek przy 1584 cm -1 obserwuje się również w kropelkach lipidów iw strukturach lipidowych szorstkiej retikulum endoplazmatycznego (RER) ( Figury 8 i 9 ). RER jest wysadzany rybosomami, które wykonują biologiczną syntezę białek (translację mRNA). Rybosomy są miejscami syntezy białek w szczepionkach mRNA. Rybosomy są zbyt małe, aby można je było zobaczyć w rozdzielczości obrazowania ramanowskiego.
Znormalizowana intensywność Ramana pasma 1584 cm -1 (na podstawie widm Ramana znormalizowanych przez normę wektorową) uzyskana dla kropelek lipidów w normalnych komórkach astrocytu (NHA) (A, B), gwiaździaka (CRL-1718) (A, C) i komórki glejaka (U87 MG)(A,D) bez szczepionki Pfizer/BioNT (kontrola, niebieska) oraz ze szczepionką Pfizer/BioNT: dawki 1 µL/mL i 60 µL/mL, czas inkubacji 1h-magenta, czas inkubacji 24h-zielony, czas inkubacji 96h-czerwony. Do obliczenia wartości istotności zastosowano jednoczynnikową ANOVA z użyciem testu Tukeya, gwiazdka * oznacza, że różnice są istotne statystycznie, wartość p ≤ 0,05.
Znormalizowana intensywność Ramana pasma 1584 cm -1 , (na podstawie widm Ramana znormalizowanych przez normę wektorową) uzyskana dla szorstkiej retikulum endoplazmatycznego w normalnych komórkach astrocytu (NHA) (A, B), gwiaździaka (CRL-1718) (A ,C) i komórki glejaka (U87 MG)(A,D) bez szczepionki Pfizer/BioNT (kontrolna, niebieska) oraz ze szczepionką Pfizer/BioNT: dawki 1 µL/mL i 60 µL/mL, czas inkubacji 1h-magenta, czas inkubacji 24h-zielony, czas inkubacji 96h-czerwony. Do obliczenia wartości istotności zastosowano jednoczynnikową ANOVA z użyciem testu Tukeya, gwiazdka * oznacza, że różnice są istotne statystycznie, wartość p ≤ 0,05.
Rysunek . 8 i 9 pokazują, że sygnał cytochromu c w kropelkach lipidów i szorstkiej retikulum endoplazmatycznym przy 1584 cm -1 zmniejsza się dla wszystkich typów badanych komórek glejowych: komórek prawidłowych, gwiaździaka i glejaka, we wszystkich okresach inkubacji i dawkach z istotnością statystyczną.
Tendencja kropelek lipidów i szorstkiej retikulum endoplazmatycznego koreluje ze zmianami obserwowanymi w mitochondriach ( ryc . 5 ).
Zmiany w składzie lipidów mogą być również monitorowane przez prążek przy 2845 cm -1 , który monitoruje stężenie triglicerydów (TAG) [ 22 , 25 , 26 ]. Postać. 9 przedstawia porównanie średnich widm Ramana (znormalizowanych według normy wektorowej) uzyskanych z analizy skupień dla mitochondriów przy wzbudzeniu 532 nm zi bez szczepionki mRNA w obszarze widma wysokiej częstotliwości.
Niedawno odkryliśmy, że intensywność sygnału Ramana w prążku przy 2845 cm -1 w kropelkach lipidowych jest znacznie wyższa w przypadku raka glejaka o wysokim stopniu złośliwości (U87 MG) niż w przypadku normalnych astrocytów (NHA), co wskazuje na wyższe stężenie TAG w lipidach raka. kropelki [ 20 ]. Wyższe stężenie TAG było związane ze zwiększoną ilością cytoplazmatycznych kropel lipidów w ludzkich komórkach glejaka w porównaniu z normalnymi astrocytami.
Ostatnio wykazaliśmy, że kropelki lipidów w komórkach rakowych są w przeważającej mierze wypełnione TAGs i biorą udział w magazynowaniu energii. Kropelki lipidów w normalnych komórkach NHA są wypełnione głównie estrami retinylu/retinolem i biorą udział w sygnalizacji, zwłaszcza w szlaku sygnalizacji JAK2/STAT6 [ 22 ]. Wyniki przedstawione na rysunku 9 sugerują, że po inkubacji z mRNA zwiększa się rola sygnalizacji. Nasze wyniki potwierdzają te, o których niedawno doniesiono, że białko kolca COVID-19 wywołuje sygnalizację komórkową w ludzkich komórkach gospodarza, co może mieć poważne implikacje dla możliwych konsekwencji szczepionek przeciwko COVID-19 [ 27 ].
3.5. mRNA cytoplazmy
mRNA szczepionki ulega translacji przez rybosomy w cytoplazmie. Dlatego szczególnie ważne jest monitorowanie zmian w cytoplazmie po inkubacji z mRNA. Postać. 11 przedstawia efekt inkubacji z mRNA w porównaniu z komórkami kontrolnymi bez mRNA w cytoplazmie.
Widać, że aktywność cytochromu c przy 1584 cm -1 w cytoplazmie wzrasta po inkubacji z mRNA dla normalnych astrocytów (NHA) przy 60 µL/mL i dla glejaka U87 MG przy 1 µL/mL. Natomiast w przypadku gwiaździaka i glejaka U87 MG sygnał Ramana przy 1584 cm -1 zmniejsza się po inkubacji z mRNA. Istotność statystyczną przedstawiono na rysunkach 10 B, C, D .
Wpływ szczepionki Pfizer/BioNT na kropelki lipidów w komórkach glejaka (U87 MG) w obrazowaniu ramanowskim: dla komórek kontrolnych U87-MG bez szczepionki (ciemnoniebieski) i po inkubacji ze szczepionką przez 96h w dawce 60 µL/mL (czerwony ).
Uwolnienie Cyt c z mitochondriów do cytozolu aktywuje apoptozę przez strumień kaspazy i proteaz.[ 28 ] Koncepcja zaprogramowania śmierci komórki przez apoptozę służy jako naturalna bariera dla rozwoju raka.[ 29 ] Dlatego wyniki dostarczają nowych narzędzi sprawdzić rolę Cyt c w przeciwapoptotycznym przełączniku przez fosforylację Tyr48.[ 30 ]
Nasze wyniki z ryc. 10 pokazują, że apoptoza jest zmniejszona po podaniu szczepionki mRNA dla gwiaździaka i glejaka, co wskazuje na zmniejszoną zdolność do walki z rozwojem raka poprzez zaprogramowaną śmierć komórki.
3.6. błonowy mRNA
Jak dobrze wiadomo, profesjonalne komórki prezentujące antygen (APC) odgrywają kluczową rolę w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznych. W stanach patologicznych również komórki nabłonkowe działają jak nieprofesjonalne APC, regulując w ten sposób odpowiedzi immunologiczne w miejscu ekspozycji. Dlatego interesujące jest monitorowanie zmian na powierzchni błon komórkowych po inkubacji z mRNA.
Postać. 12 przedstawia wpływ inkubacji z mRNA w porównaniu z komórkami kontrolnymi bez mRNA na powierzchni błony.
Znormalizowana intensywność Ramana pasma 1584 cm -1 , (na podstawie widm Ramana znormalizowanych przez normę wektorową) uzyskana dla cytoplazmy w normalnych komórkach astrocytu (NHA) (A,B), gwiaździaka (CRL-1718) (A,C ) oraz komórki glejaka (U87 MG)(A,D) bez szczepionki Pfizer/BioNT (kontrola, niebieska) oraz ze szczepionką Pfizer/BioNT: dawki 1 µL/mL i 60 µL/mL, czas inkubacji 1h-magenta, czas inkubacja 24h-zielony, czas inkubacji 96h-czerwony. Do obliczenia wartości istotności zastosowano jednoczynnikową ANOVA z użyciem testu Tukeya, gwiazdka * oznacza, że różnice są istotne statystycznie, wartość p ≤ 0,05.
Znormalizowana intensywność Ramana pasma 1584 cm -1 , (na podstawie widm Ramana znormalizowanych przez normę wektorową) uzyskana dla błony komórkowej w normalnych komórkach astrocytu (NHA) (A, B), gwiaździaka (CRL-1718) (A, C) i komórki glejaka (U87 MG)(A,D) bez szczepionki Pfizer/BioNT (kontrola, niebieska) oraz ze szczepionką Pfizer/BioNT: dawki 1 µL/mL i 60 µL/mL, czas inkubacji 1h-magenta, czas inkubacji 24h-zielony, czas inkubacji 96h-czerwony. Do obliczenia wartości istotności zastosowano jednoczynnikową ANOVA z użyciem testu Tukeya, gwiazdka * oznacza, że różnice są istotne statystycznie, wartość p ≤ 0,05.
Widać, że aktywność cytochromu c przy 1584 cm -1 spada dla glejaka U87 MG z istotnością statystyczną przy wartości p ≤ 0,05.
Tabela 1 . podsumować wyniki przedstawione powyżej dla pasma intensywności Ramana przy 1584 cm -1 dla mitochondriów, jąder lipidowych kropelek, cytoplazmy i błony komórkowej dla linii komórkowych NHA, CRL1718 i U-87 MG, przedstawione jako średnia ± SD na podstawie znormalizowanych widm Ramana . (normalizacja: podzielona przez normę).
Porównanie pasma intensywności Ramana przy 1584 cm -1 dla mitochondriów, jądra, kropelek lipidów, cytoplazmy i błony komórkowej dla linii komórkowych NHA, CRL1718 i U-87 MG, przedstawione jako średnia ± SD na podstawie znormalizowanych widm Ramana (normalizacja : podzielone przez normę). Intensywność prążków Ramana wzięto ze znormalizowanych widm wektorów norm, liczba komórek=3.
4. Wnioski
Pokazaliśmy, że nowe narzędzia obrazowania ramanowskiego, które przedstawiamy w tym artykule, otwierają ekscytujące możliwości nowych sposobów zrozumienia powiązań między szlakami raka, odpowiedziami immunologicznymi i rozpoznaniem metabolitów, które regulują te szlaki.
Wykorzystaliśmy spektroskopię Ramana do monitorowania zmian stanu redoks cytochromów mitochondrialnych w ludzkich komórkach mózgu in vitro normalnych astrocytów, gwiaździaka, glejaka po inkubacji ze szczepionką mRNA. Zaobserwowaliśmy wpływ szczepionki mRNA na biodystrybucję różnych składników chemicznych, w szczególności cytochromu c, w specyficznych organellach komórek glejowych mózgu człowieka: jądrze, mitochondriach, kropelkach lipidów, cytoplazmie, siateczce endoplazmatycznej szorstkiej i błonie.
Wykazaliśmy, że szczepionka mRNA (Pfizer) zmienia mitochondria poprzez regulację w dół cytochromu c, co skutkuje niższą efektywnością oddychania (fosforylacja oksydacyjna) i niższą produkcją ATP. Może prowadzić do osłabienia odpowiedzi układu odpornościowego.
Spadek stężenia amidu I w potencjale błony mitochondrialnej może sugerować pogorszenie czynnościowe translokatora nukleotydu adeninowego. Szczepionka mRNA znacząco modyfikuje syntezę lipidów de novo w kropelkach lipidowych. Wyniki przedstawione w pracy sugerują, że po inkubacji z mRNA wzrasta rola funkcji sygnalizacyjnej kropel lipidowych. Obserwowane zmiany w profilach biochemicznych po inkubacji z Pfizer/BioNT w określonych organellach komórek glejowych są podobne do tych, które obserwujemy dla raka mózgu w porównaniu ze stopniem agresywności.
Finansowanie
Praca ta została wsparta działalnością statutową 2021: 501/3-34-1-1.
Konflikt interesów
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w napisaniu manuskryptu lub w decyzji o opublikowaniu wyników.
Autorskie Wkłady
Konceptualizacja-HA; pozyskiwanie finansowania – HA; dochodzenie- BB-P, KB; wizualizacja- B. BP.; projekt pisemny-oryginalny - HA, B. BP.; pisanie - BB-P., KB; przegląd - HA; redakcja-BB-P., KB Wszyscy autorzy przeczytali i wyrazili zgodę na opublikowaną wersję manuskryptu.
Oświadczenie o dostępności danych
Surowe dane stanowiące podstawę wyników przedstawionych w badaniu są dostępne w Instytucjonalnym Dostępie do Danych Politechniki Łódzkiej. Prośbę o udostępnienie tych danych należy kierować do Kierownika Pracowni Laserowej Spektroskopii Molekularnej Instytutu Stosowanej Chemii Radiacyjnej Politechniki Łódzkiej. Prośby o udostępnienie danych można przesyłać drogą mailową na adres sekretariatu Instytutu Chemii Promieniowania Stosowanego: mitr{at}mitr.p.lodz.pl .
